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博亚体育app官网入口_Cell Research :治疗隐性遗传性耳聋,舒易来/李华伟/左二伟开发HMEJ基因修复体系

点击量: 992     作者: 博亚体育app官网入口     时间: 2022-03-05 09:31:54

Cell Research :医治隐性遗传性耳聋,舒易来/李华伟/左二伟开辟HMEJ基因修复系统
  1. HMEJ基因修复系统

来历:生物世界 2022-03-01 14:22

  据世界卫生组织 (WHO) 统计,跨越全球生齿的5%,即4.66亿人得了致残性听力障碍,此中3400万是儿童。虽然研究发现跨越120个基因与非综合征型或综合征型耳聋相干(http://hereditary hearing loss.org/),但临床上对遗传性感音神经性聋的医治除佩带助听器和植入人工耳蜗等,还没有任何有用的药物医治手

据世界卫生组织 (WHO) 统计,跨越全球生齿的5%,即4.66亿人得了致残性听力障碍,此中3400万是儿童。虽然研究发现跨越120个基因与非综合征型或综合征型耳聋相干(http://hereditary hearing loss.org/),但临床上对遗传性感音神经性聋的医治除佩带助听器和植入人工耳蜗等,还没有任何有用的药物医治手段。

在非综合征型遗传性耳聋中,常染色体隐性遗传性耳聋占80% (Korver et al., 2017)。对隐性遗传性耳聋,最好的医治方式是对基因突变位点进行精准地修复,进而久长地恢复听力。CRISPR/Cas9基因编纂系统是最近几年来鼓起的新型基因编纂东西,已在疾病的医治中表示出了庞大的利用潜力。该系统首要由sgRNA和Cas9两部门构成,两者构成复合体, sgRNA与靶位点反向互补实现定位后,同时辨认PAM序列,Cas9核酸酶切割DNA,致使DNA产生断裂。

细胞内首要有两种DNA毁伤修复机制,非同源结尾毗连(Non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination,HR)。当有外源性DNA模板存在时,操纵HR可以实现序列的肆意切确变换或定点插入,但其效力不高,特别在非割裂细胞中,HR的效力更低,这极年夜限制了HR在基因医治范畴的利用。

研究团队在先前的研究中经由过程在同源模板两侧引入sgRNA的靶位点,开辟了一种以同源臂介导的结尾接合(Homology-Mediated End Joining,HMEJ)为根本的基因敲入策略 (Yao et al., 2017),在体内、体外均实现了高效而切确的整合(图1)。HMEJ介导的基因敲入方式为包罗基因编纂动物模子的成立和遗传性疾病的精准靶向基因医治等供给了广漠的前景。今朝,还没有基在CRISPR/Cas9介导的HR策略进行耳聋基因医治的体内研究。

复旦年夜学从属眼耳鼻喉科病院舒易来研究员、李华伟传授与中国农业科学院(深圳)农业基因组研究所左二伟研究员等团队合作,在Cell Research 期刊上颁发了题为:Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice 的研究论文。

该研究以AAV作为基因医治的递送载体,操纵HMEJ基因敲入方式精准改正了Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠听觉毛细胞中的点突变,恢复了内毛细胞静纤毛形态,并光鲜明显改良小鼠的听觉功能长达医治后6个月。

这是首个基在CRISPR/Cas9-HMEJ手艺医治隐性遗传性感音神经性聋成功的研究,为遗传性耳聋的精准医治和潜伏的临床转化供给了强有力的科学证据。

Klhl18lowf小鼠模子是指Klhl18 p.V55F产生错义点突变(Chr9:110455454 C>A),其纯合子小鼠表示为第4周最先呈现以低频为主的渐进性听力降落,跟着春秋增加,听力降落逐步累和其它频率,最后成长为全频型严重耳聋,而杂合子小鼠听力正常,表示为隐性遗传。Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠模子在形态学方面表示为耳蜗内毛细胞纤毛的形态异常(Ingham et al., 2021)。

该研究起首针对基因Klhl18lowf突变位点设计、挑选和构建了HMEJ医治系统。在新生小鼠皮肤成纤维细胞中进行体外sgRNA挑选,发现sgRNA2的效力较高。将表达Cas9的质粒与携带HMEJ同源模板和表达sgRNA2的质粒配合转染至带有Klhl18lowf突变的成纤维细胞中,发现突变位点较着获得了的改正,且sgRNA2不发生较着的脱靶编纂。

体外尝试证实设计的HMEJ系统可以切确改正Klhl18lowf点突变后,该研究进一步在体内摸索该系统的疗效。用双AAV包装CRISPR/Cas9-HMEJ基因修复系统,即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor,将其在Klhl18lowf新生鼠诞生后1天(P1)显微打针至小鼠的内耳。在小鼠P14和10周龄时,体内编纂效力检测成果注解,双AAV医治系统在体成功改正了Klhl18基因C>A点突变,跟着编纂时候的耽误,10周龄的修复效力提高了约3倍,而在未打针耳中,没有不雅察到较着的碱基插入、缺掉或突变碱基的改正。

经由过程扫描电镜手艺,与野生型小鼠比拟,发现8周龄的未医治纯合突变小鼠的内毛细胞最高一排静纤毛表示为更长、更细且顶端成尖细的锥形,而医治后的小鼠有部门内毛细胞的静纤毛恢复正常的形态,表示为最高一排静纤毛年夜部门呈柱形且更短。在医治后小鼠耳蜗的顶圈和中圈,平均约16%的内毛细胞具有正常或接近正常的纤毛束形态。听性脑干反映(auditory brainstem response, ABR)测试成果显示打针AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ医治系统后8周,打针耳的ABR阈值在8、16、24和32 kHz均比未打针耳较着降落,且医治结果延续至小鼠24周龄(尝试不雅察期)。电心理检测成果显示,在较长时候(200 ms)的去极化脉冲刺激前提下,未打针耳的内毛细胞膜电容与野生型比拟较着降落,而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ医治系统能将打针耳内毛细胞膜电容恢复至野生型程度,即医治系统修复了内毛细胞延续囊泡释放功能。

综上所述,基在CRISPR/Cas9-HMEJ策略可对体内内耳毛细胞中的基因突变位点进行精准的改正,恢复了耳蜗部门内毛细胞静纤毛形态、修复了内毛细胞延续囊泡释放功能并持久改良了Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠的听觉功能,为终究在人类隐性遗传性耳聋和其它器官系统隐性遗传性疾病中实现平安、持久的基因医治供给了科学根据和参考。(生物谷Bioon.com)

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